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quarta-feira, agosto 4, 2021

Métodos Enzimáticos

Autoria: Silvia Bandiera Borges

Objetivo:
Determinar o nível de glicose em amostras através do método enzimático.

Introdução Teórica:
Enzimas é um grupo de substâncias orgânicas de natureza protéica, com atividade intracelular ou extracelular que têm funções catalisadoras, induzindo reações químicas que, sem a sua presença, dificilmente aconteceriam. Também aumentam a velocidade das reações químicas, possibilitando o metabolismo dos seres vivos. Algumas enzimas são armazenadas nos lisossomos (uma das organelas das células).
Para cada nutriente existe uma enzima que depois pode ser reaproveitada, exemplo:
 Amido – amilase,
 Carboidrato – carboidrase,
 Lipídio – lípase,
 Sacarose (um tipo de carboidrase),
 Proteína protease,
 Lactose – lactase,
 Maltose – maltase

A principal função biológica dessa categoria de compostos orgânicos (Carboidratos) é a liberação de energia para o trabalho celular e, nesse caso, a glicose é o principal fornecedor de energia para a célula.
A glicose ou dextrose é um carboidrato do tipo monossacarídeo. Cristal sólido de sabor adocicado, de formula molecular C6H12O6, encontrado na natureza na forma livre ou combinada. Juntamente com a frutose e a galactose, é o carboidrato fundamental dos carboidratos maiores, como sacarose e maltose. Tanto o Amido como a celulose são polímeros de glicose. No metabolismo, a glicose é uma das principais fontes de energia e fornece 4 calorias de energia por grama. A glicose hidratada (como no soro glicosado) fornece 3,4 calorias por grama. Sua degradação química durante o processo de respiração celular dá origem a energia química (armazenada em moléculas de ATP – entre 36 e 38 moléculas de ATP por moléculas de glicose), gás carbônico e água.
A glicose é essencial para a função do cérebro e dos eritrócitos. O excesso de glicose é armazenado na forma de glicogênio no fígado e nas células musculares. A dosagem de glicose no sangue é um dos exames mais solicitados aos laboratórios clínicos e tem como finalidade diagnosticar e acompanhar o tratamento de portadores de algum distúrbio no metabolismo de carboidratos que levem a situações de hipoglicemia ou hiperglicemia. Um dos problemas mais freqüentes envolvendo carboidratos é o diabetes mellitus, que pode ser descrito como um grupo de doenças metabólicas de diversas etiologias, caracterizado por hiperglicemia, glicosúria e outras manifestações clínicas decorrentes do comprometimento, principalmente, do sistema vascular e do sistema nervoso, levando a lesões em múltiplos órgãos, em especial olhos, rins e coração.

Fórmula Estrutural da Glicose.

Materiais e Reagentes:

Material Quantidade Usada
Balão Volumétrico de 100 ml 1
Béquer 50 ml 3
Bastão de vidro 1
Cubeta de plástico 4
Espectrofotômetro modelo 22ED, marca Tecnal 1
Piceta 1
Pipeta de Volume Fixo de 01 ml, marca Kacil 1
Pipeta de Volume Fixo de 10 µ l, marca Kacil 1
Ponteira de plástico de 01 ml 2
Ponteira de plástico de 10 µ l 2
Suporte de plástico 1
Tubo de ensaio 4
Kit Testline (contendo glicose reativo único de 250ml e glicose padrão 100mg/dL de 2ml) 1

Reagentes Quantidade Usada
Água Destilada 100ml
Coca-Cola Light 1 ml
Glicose Padrão 100mg/dL 10 µ l
Glicose Reativo Único 4ml
Plasma Sanguíneo 10 µ l

Procedimento e Observações:

1- Colocamos em um béquer 30 ml de Coca-Cola Light e com o bastão de vidro mechemos esta solução até que todo o gás que nela continha fosse retirado. Após a retirada de todo o gás da Coca-Cola Light, retiramos 1 ml desta solução e colocamos em um balão volumétrico de 100 ml completando o mesmo com água destilada para que a Coca-Cola Light fosse diluída em 100 vezes.

2- Reservamos o balão volumétrico com a Coca-Cola Light diluída em 100 vezes.

3- Em um tubo de ensaio, colocamos 1ml de Glicose Reativo Único usando a Pipeta de Volume Fixo de 01 ml da marca Kacil com a ponteira de plástico de 01 ml e reservamos o mesmo no Suporte de plástico. Designamos este tubo de ensaio como sendo a amostra de número 1. Esta amostra será usada para zerar o Espectrofotômetro.

4- Em um tubo de ensaio, colocamos 1ml de Glicose Reativo Único usando a Pipeta de Volume Fixo de 01 ml da marca Kacil com a ponteira de plástico de 01 ml e 10 µl de Glicose Padrão 100mg/dL usando a Pipeta de Volume Fixo de 10 µl da marca Kacil com a ponteira de plástico de 10 µl. Agitamos levemente a solução e reservamos o mesmo no Suporte de plástico. Designamos este tubo de ensaio como sendo a amostra de número 2. Esta amostra será usada para regular o valor correto conforme o padrão de glicose no Espectrofotômetro.

5- Em um tubo de ensaio, colocamos 1ml de Glicose Reativo Único usando a Pipeta de Volume Fixo de 01 ml da marca Kacil com a ponteira de plástico de 01 ml e 10 µ l de Coca-Cola Light diluída em 100 vezes em água destilada usando a Pipeta de Volume Fixo de 10 µl da marca Kacil com a ponteira de plástico de 10 µl. Agitamos levemente a solução e reservamos a mesma no Suporte de plástico. Designamos este tubo de ensaio como sendo a amostra de número 3.

6- Em um tubo de ensaio, colocamos 1ml de Glicose Reativo Único usando a Pipeta de Volume Fixo de 01 ml da marca Kacil com a ponteira de plástico de 01 ml e 10 µ l de Plasma Sanguíneo usando a Pipeta de Volume Fixo de 10 µl da marca Kacil com a ponteira de plástico de 10 µl Agitamos levemente a solução e reservamos a mesma no Suporte de plástico. Designamos este tubo de ensaio como sendo a amostra de número 4.

7- Aguardamos um tempo de espera de 15 minutos.

8- A amostra de nº 03 antes sem cor, passou a ter a cor rosa claro enquanto que a amostra de nº 04 passou a ter um tom na cor de rosa escura quase vinho. Não houve variação de cor acentuada nas amostras de nº 01 e 02 permanecendo da mesma cor inicial.

9- Cada amostra foi transferida do seu tubo de ensaio para respectiva cubeta de plástico e uma a uma foi analisada no Espectrofotômetro.
Resultados:

Glicose
Glicose + O2 + H2O → Ácido glucônico + H2O
Oxidase

Peroxidase
2H2O2 + 4-Aminocentipirina + fenol → Quinonimina + 4H2O

Posicionamento das amostras inicialmente:
Reagentes Tubo de Ensaio nº 01 Tubo de Ensaio nº 02 Tubo de Ensaio nº 03 Tubo de Ensaio nº 04
Branco Padrão Coca Cola Light Plasma
Padrão de Glicose


10 µ l



Amostra



10 µ l 10 µ l
Reagente 01 ml 01 ml 01 ml 01 ml

Posicionamento das amostras após a análise do Espectrofotômetro:
Análise no Espectrofotômetro Tubo de Ensaio nº 01 Tubo de Ensaio nº 02 Tubo de Ensaio nº 03 Tubo de Ensaio nº 04
Branco Padrão Coca Cola Light Plasma
Valores obtidos 0,00 0,29 0,00 1,11

Tubo de Ensaio nº 03 – Coca Cola Light
0,29


100mg/dL
0,00


x
Resultado: x = 0,00 mg/dL

Tubo de Ensaio nº 04 – Plasma
0,29


100mg/dL
1,11


x
Resultado: x = 382,75mg/dL
Conclusão:

Ao passar os 15 minutos, notamos que a amostras de nº 03 ficou na cor rosa claro enquanto que a amostra de nº 04 passou a ter um tom na cor de rosa escuro, tal observação nos fez concluir que este escurecimento era causado pela quantidade de glicose que ela apresentava, ou seja, quanto mais glicose mais escura ela ficaria. Essa conclusão foi confirmada pelo Espectrofotômetro, pois a amostra de n º 03 onde se encontrava a Coca Cola Light acusou o resultado de 0,00 mg/dL ou seja, não havia glicose. Já a amostra de n º 04 onde se encontrava o Plasma Sanguíneo acusou o resultado de 382,75mg/dL indicando que este plasma, com tal volume de glicose presente, seria de uma pessoa diabética.
Usando a metodologia, o nosso grupo conseguiu atingir o objetivo proposto de determinar o nível de glicose em amostras através do método enzimático.

Bibliografia:

GUYTON C. Arthur Tratado de Fisiologia Médica. 7º edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 1990. 641p.

Indice de Exames: Online. Disponível em:
 Acesso em: 04 março de 2006.

A Enciclopédia livre Wikipedia: Online. Disponível em:
 Acesso em: 04 março de 2006.
 Acesso em: 04 março de 2006.

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